Orientador: Ricardo Franco (Ciência ID: 9317-7493-96B7)
DESCRIÇÃO:
O objetivo é desenvolver um método simples, baseado em centrifugação, para a separação de proteínas ricas em histidinas ou com caudas de histidina a partir de um meio complexo, utilizando nanopartículas de ouro em forma de estrela e funcionalizadas com Ni-NTA. Tal sistema de nanopartículas plasmónicas irá permitir a posterior deteção recorrendo a espetroscopia de Raman aumentada pela superfície (SERS). Inicialmente, como prova de conceito, o sistema será testado para purificar Histidine Rich Protein II (HRPII) de Plasmodium falciparum (Pf), um biomarcador de malária, recombinante e contendo uma cauda de histidinas, a partir de um lisado celular. Serão utilizadas técnicas tais como SDS-Page, espetroscopia de UV-visível, eletroforese em gel de agarose e Western blot para avaliar a eficiência da purificação. Além disso, o processo de purificação com nanopartículas será comparado com uma coluna de cromatografia de afinidade com metal imobilizado (IMAC) comumente usada, como controlo positivo e com uma purificação usando nanopartículas funcionalizadas com ácido 11-mercaptoundecanóico (MUA) como controlo negativo. Com base nos resultados do procedimento de purificação, a deteção por SERS será utilizada juntamente com Western blot utilizando nanopartículas plasmónicas conjugadas com anticorpos anti-PfHRPII e funcionalizadas com uma sonda de Raman em membranas de nitrocelulose. Esta deteção por SERS será comparada com um processo de deteção anteriormente desenvolvido no laboratório, em que o anticorpo secundário com sinal fluorescente é substituído pela deteção de cor das nanopartículas conjugadas com anticorpos anti-PfHRPII. Finalmente, o sistema será testado contra o sangue de pacientes infetados com malária, com o objetivo de detetar seletivamente a proteína PfHRPII.